| Microinjection
のやり方 mamalian細胞に対するinjection限定です。 はじめに ここではmamalian細胞に対するinjectionのやり方について記しています。 「うてない」時のために書きました。 装置は、Laits（ライカ）のマニュアルとeppendrufのセミオートマしか使ったことがありませんので、これら限定です。 方針は「数をうつ」です。わずかな数の細胞のみで判断するのは危険です。単にinjectionのショックによって細胞が死んだ、といったback groundをresultsとしているかもしれません。ただinjectionは大変精神に対する負担が大きい実験で、長時間続けていると精神崩壊する こともありますので、ここでは短い時間で多くの細胞に対するinjectionを目標とします。やりこむことで完全オートマチックの機械よりも速く1分間 で50個のinjectionも可能です。「機械より早い」と呼ばれるでしょう。 注意：自己責任でおこなってください。 目次 必要なもの microinjectionの装置： 倒立顕微鏡とマ ニュピレーターで構成されています。倒立顕微鏡が蛍光顕微鏡だとdouble injectionも可能です。 Laits。ライカの顕微鏡での名前だそうです。全てが マニュアルで針の移動は歯車でおこない、sampleはフロリナート液で押し出します。圧力をかける際は、フロリナートを詰めた注射器の後ろにネジ回しを 回すことで行うため、感に頼ることになります。 よい点。全てがマニュアルで操作が直 に伝わるために、使い込むと機械が体の一部になる。針を通じて細胞表面の凹凸を感じることができる。 悪い点。市販の針をつけることができ ない。フロリナートはフロンで環境に悪そう。 eppendorfのセミオートマ。針の上下の位置を覚 えさせることで自動的に針が動く。圧力は窒素ガスでかけ、圧力表示が数値で見られる。 よい点。ワンクリックで injectionできるため、素早くうてる。圧力も再現性よくかけられる。 悪い点。ステージを動かすと、高さが 変わるために、その度に高さ設定をしないといけない。 お金があるところだと、温度を一定に保つプレート、もしくはフード、更にはtime rapの実験を行うためにCO2を満たすことできる装置をもっているところもあるようです。大概こういう大がかりの装置を持っているところは、思わぬお金 が取れて買ってしまったけれども実際は使っていないものです。煤をはらいに行ってあげましょう。Injection装置を卸している業者に訊いて探すと、 もっている研究室を見つけやすいと思います。 針： 市販か自作の針になります。市販のものは一つ5ド ルくらいと高価ですが、もしお金があるなら市販のものにしましょう。高いだけあって、とてもうち易 いです。針を作る際のガラス管はnarishigeを使っています。 針を作る機械： やはり市販の針は高価ですから、 microinjectionの装置があるならこの機械もあるでしょう。倒立式と横になったものがありま す。倒立式ですと上と下で針の形状が異なります。本当の名前はcapillary pullerと言うとか言わないとか。自分の感じとしては、温度が高いとうちやすいけど詰まりやすく、温度が低いと入りにくいが詰まりにくいものができま す。 たまごめ：sampleを針につめるためのものです。以 前はガラス管を熱して伸ばしたものを使っていましたが、現在はeppendorufのものを使って います。この方が細かいガラスの破片が針先に入り詰まる原因も減ります。 スライドガラスとdish： 細胞をまくためのスライド ガラスです。以前は3.5cmの四角形のものにtemplateで大きな円2つ小さな円をダイアモ ンドペンでL字型に傷を入れていました。こうすると表と裏がわかって、細胞をまいた面を間違えないわけです。更にガラスを王水できれいにした後、乾熱滅菌 していました。 現在は12mmの円のfisherの細胞をまくためのpolylysineコーティングをしたものに、ダイアモンドペンでフリーハンドで一つの円を描いた 使っています。セットで120ドルぐらいと高価です。3.5cm円のdishに3.5cmの四角のものは1枚しか置けませんが、12mm円は5枚置くこと ができます。よい点として、同じdish内ですから、全てのガラスに均一に細胞がまくことができますし、backもそろいます。更に transfectionといった作業を前処理する場合、プラスミドを倹約できますし、transfection効率も均一になります。染める際の抗体も 倹約できます。ただ裏表がわからないので慣れてから使うのがよいでしょう。 ガラスはエタノールを浸し、乾燥させ、裏表UVをあてて終わりです。細胞をまいた後、少なくとも2日後にはinjectionしていますから、 condamiすることもありません（少なくとも自分は）。更に用意が細胞をまく当日、30分程度でできますから、実験をbrakeすることもありませ ん。「スライドガラスが用意されていない、だから実験ができない」と自分自身に言い訳もできませんし、そう言う、さぼり癖のある学生に言い訳をさせること もありません。 injection marker： injectionした細胞を判断するために、一緒に蛍光dyeをうちます。ただこの蛍光dyeがアグッて injectionのじゃまを することが多々ありますので、よーくsampleを遠心してから使いましょう。ものがタンパクで抗体があるなら、injection後抗体で染めて、もの が抗体なら二次抗体を使って染めましょう。 injection sample（もの）： タンパク質、抗体、mRNAをうったことがあります。もちろんDNAも可能でしょう。タンパク質なら最高 30mg/mlの濃さの ものをうったことがあります。mRNAも分解され易いかと思いましたが大丈夫でした。 sampleを氷中に置いておくとアグル、室温に置くべしと言う人もいました。sampleを20minほど遠心した後、上精を新しいチューブに移して、 これを使っています。 iPod： 音楽を聴きながら実験することにより精神崩 壊を 防ぎます。CDプレイヤーもいいですが収録できる曲数で圧倒的にiPodが便利です。 スケジュール 1.細胞をまく。2.細胞を同調、もしくはtransfection。3.microinjection。4.細胞を染色。5. その日（必ず）のうちに蛍光顕微鏡で観察。 細胞をまく際はダイアモンドペンでガラスを傷つけた面に細胞をまいています。 次が一番のポイントです。microinjectionしたその日に染色することになった場合、fix、染色、マウンティングした後、直ぐに顕微鏡で細胞 を観察しましょう。injectionして疲れたからといって途中で止めて家に帰ってはいけません。まず、顕微鏡で観察する頃には夜になりますから、コン ペティターがいなくなって顕微鏡が自由に使えます。fix、マウンティングして実験を止めると、蛍光が減衰して観察できない可能性があります。大事なこと は結果です。microinjectionをして燃え尽きてはいけません。 「うてない」時にどうする か。 まずはsampleを疑いましょう。針にsampleが詰まる原因はsampleがアグッたり気泡が入ることによるものと思われます。試しに0.22マイ クロンのフィルターを通したPBSをinjectionしてみましょう。もしこれを問題なくうてた場合はsampleが原因です。sampleと混ぜた injection markerの蛍光物質もアグることがあります。 sampleの量が多いのならフィルターを通す、そうでないなら遠心して上清のみ異なるチューブに移して使いましょう。この際室温でおこなう方がアグらな いと言う人もいます。ピペッティングする際も気泡が入らないよう丁寧におこないましょう。 原因がsampleではなく針やたまごめの小さなガラスのばりが詰まる原因になることもあります。お金があるなら市販のものを使いましょう。 一つの細胞に執着するのを止めましょう。その細胞とは縁がなかったと諦めて次の出会いに期待しましょう。数うてば当たる、です。 応用編 やりすぎると細胞にダメージを与えるおそれがありますが、幾つかのテクニックを書いておきます。 1.先をちょこっと： 針先をほんの細胞にふれるくらい で止め、injectionをおこなう。針先をぐいっと細胞に入れることにより針先が痛んでしまっ て、うてなくなってしまうことがあります。これを避けるために丁寧にinjectionをおこないます。うち初めは好調だったのに次第にうてなくなる経験 したことがある人は多いと思います。 2.スクラッチ： 文字通り針をガラス表面を擦ることに より、針先を割ること。もっともメジャーで有効な方法です。細胞をまいているガラスの表面のダイアモンドカッターの跡と直角に交わるように擦って 割るのがやり易いです。もしガラスの傷を付けた面が下向きだった場合、自分はガラスの側面を使っています。やりすぎるとsampleがあふれ出てきて大変 なこ とになります。 3.はさみ： 細胞周辺部の薄い処をねらって、 ガラスと針で細胞を挟み込むようにinjectionをおこなうこと。 4.勢い： 針をクイックにうち下ろす。核への injectionをおこなう際、細胞質にsampleがいってしまうのを防ぐために勢いよく針を入れこ む。タッチアンドゴーの様におこなうこともある。 5.ごね（ごね得）： 針先を細胞中に入れた状態で、針 を左右上下にかき混ぜ、更に圧力をかけたりしてsampleが偶然に細胞中に入りこむのを期待する 方法。だだっ子の様に粘ることにより成功を得る。やりすぎると細胞を死に追いやる。 6.引き（引き際が肝心）： なぜか針を入れるときでは なく引き抜くときにsampleが入ることがある。 7.MAX： 針先を細胞に入れた状態で圧力maxボタ ンを押すこと。M期の細胞にinjectionする際この方法でうまくいったこともあった。爆発す る細胞もあった。粘性の高いsampleをinjectionする際うまくいくこともある。手動のinjecterではできない。 8.角度： 針を下ろす際、針の細胞に対する角度を変え ること。 9.休む（寝る）: どうしてもsampleが入ってく れないとき、尿意を我慢しているときなど、いらいらしてきて集中できません。そんなときは一服しましょう。Time courseで焦っているときでも休息は可能です。自分は1plate、10分と割り当てて、最初の5分以内に100個以上の細胞にinjectionを 行い、残りの5分は寝ていました。慣れると5分で夢を見ることもできます。こうやって10plates以上のtime courseをこなしていました。 最後に もっとも成功確率の高い方法は「うまい人にやってもらう」です。こんなスキルに依存する実験を時間をかけて習得するのは馬鹿らしすぎます。共同研究をす るなりペーパーに名前を載せるなりして「うまい人」にやってもらいましょう。 アメリカにいたときポストドクは誰も新たにinjectionの実験をやろうとはしませんでした。全部技官にやってもらっていました。時間を有効に使う賢 いやり方だと思います。 そして究極の方法は、injectionをやらないでいい方法を考えることです。transfectionなりで解決できるならこれを使いましょう。 これもアメリカでの出来事ですが、酵母を扱う際、テトラッドアナリシスをどうしても必要にならない限り使わない人が多々いました。テトラッドは非常に便利 ですがスキルに依存する実験方法だからです。逃れられるなら回り道を探す、これも一つの解決策だと思います。 9/18/03 初版 9/19/03, 10/30/03 修正 一番上に ホームに |